常遇到菌落PCR試劑盒問題疑難解答

　　菌落PCR試劑盒常遇到的疑難解答：

　　Q：樣品沒有擴(kuò)增產(chǎn)物而陽性對(duì)照有產(chǎn)物出現(xiàn)。

　　A：可能是樣品DNA溶液中含有的細(xì)胞裂解物抑制了PCR擴(kuò)增。建議將樣品DNA溶液用水稀釋5-100倍后再擴(kuò)增（兩個(gè)梯度）。

　　Q：樣品和陽性對(duì)照都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

　　A：重新設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)參數(shù)或引物。

　　Q：陽性對(duì)照有大小不同的兩條擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

　　A：如果用戶自備的引物一條識(shí)別載體，一條識(shí)別插入片段，模板又是連接反應(yīng)液，則出現(xiàn)此情況屬于正常，因?yàn)閮煞N插入方向的DNA在連接反應(yīng)液里面都存在。

　　Q：菌落PCR試劑盒陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

　　A：如果是引物二聚體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。如果片段跟陽性對(duì)照一樣，可能有污染，其他陽性結(jié)果也可能是污染引起，建議找到污染原因后再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　Q：一個(gè)普通菌落中一般有多少殘留的未轉(zhuǎn)化的DNA？

　　A：如果使用100ng的插入片段進(jìn)行連接反應(yīng)，用1/10的連接反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再用1/10的轉(zhuǎn)化菌液涂盤，有一半插入片段進(jìn)入細(xì)菌計(jì)算，則有0.5ng的插入DNA片段游離在細(xì)胞外，分布培養(yǎng)皿表面。一個(gè)培養(yǎng)皿的表面積一般為55cm2，一個(gè)直徑為5mm的菌落（面積約0.2mm2）則平均可能含有3pg左右的游離狀的插入DNA片段，如果使用插入片段專一性的PCR引物，則足夠在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生假陽性。